Пироплазмоз собак в Европе: обзор.Часть 3

Исследование мазка крови является полезным диагностическим методом   клинической диагностики пироплазмоза собак. Микроскопическая оценка продолжает быть самым простым и наиболее доступным диагностическим тестом для большинства ветеринаров. Однако чувствительность этого метода ниже, чем методов  молекулярной  диагностики  для постановки диагноза на пироплазмоз и в большей степени зависит от вида бабезий, вызвавших заражение собаки. Две формы  бабезий, большие (Рис. 2) и малые (Рис. 3, 4), можно дифференцировать с помощью мазка крови. Хотя световая  микроскопия высокоспецифична  и может быть использована для диагностики большинства больных собак, зараженных большими формами  бабезий (например,  B. canis) [4,84], она  реже выявляет инфекции, вызываемые B. vogeli [84]. Для диагностики  этой инфекции более чувствительны молекулярные , основанные на ПЦР-методы, [93]. Мелкие пироплазмы (В. gibsoni, В. microti-СП.) трудно наблюдать с помощью световой микроскопии, которая  имеет относительно плохую до умеренной чувствительность [35], и необходима экспертиза.

 

Фото 2 . Микрофотография, демонстрирующая большую форму бабезий (B. Canis) в эритроцитах собаки.Scale-bar: 10 μm

 

Фото 3 . Микрофотография, демонстрирующая малую   форму бабезий (B. gibsoni, стрелка) в эритроцитах собаки.Scale-bar: 10 μm

 

Фото 4 . Микрофотография, демонстрирующая малую   форму бабезий ((B. microti-like, стрелка) в эритроцитах собаки.Scale-bar: 10 μm

 

Поэтому наблюдение мазка  должно  быть “первым  шагом” диагностической оценки , с отрицательными результатами, требующими переоценку методом ПЦР, используя кровь   или ткань селезенки (Изобр. 5). Кроме того, чтобы определить вид пироплазмморфологического  наблюдения недостаточно, и необходимы молекулярные методы, такие как ПЦР и секвенирование. Свежая кровь всегда рекомендуется для мазков.

Кроме того, наблюдение за большими бабезиями   в капиллярных  мазках крови , таких, как полученные из уха или когтя, по видимому, более информативно, благодаря большей численности паразитов в этом типе образцов.[10, 88]. Предел обнаружения паразитов в тонком мазке крови , по видомому, соответствует паразитемии  0,5 % [88].

 

Собаки с клиническими симптомами и клиникопатологическими нарушениями, совместимыми с пироплазмозом собак.

 

1 Важно различить большие и малые формы, вследтствие того факта, что клинический подход, лечение и прогноз сильно различаются.

2 Важно использовать молекулярные методы, которые дифферецируют виды Babesia.

3 Она показывает на контакт с Babesia., но не дифференцирует между видами.

4 а. Повторите через 4-8 недель для оценки сероконверсии

   б  Исключите другие совместимые заболевания.

  Серологические тесты, которые могут быть использованы, являются  количественными  методами, такими как непрямая  иммунофлюоресценция (IFAT), или иммуноферментный анализ (ELISA).. Одно из преимуществ применения  IFAT или  ELISA  заключается в том, что эти тесты позволяют определить уровень антител и, следовательно, установить, являются ли они высокими или низкими. По этой причине, важно, чтобы отправить образцы в лабораторию, которая стандартно использует количественные серологические методы и может определить  заключительный титр для IFAT или оптическую плотность для ELISA [42]. Быстрые методы для обнаружения анти-антител против бабезий  в клинических условиях еще не являются коммерчески доступными  и предложены только тесты для определения  “положительный/отрицательный” результат, без определеия титра антител или уровня. Кроме того, количественные методы обычно более чувствительны и специфичны, чем экспресс – методы.

 

 В настоящее время нет универсального антигена, разработанного  для скрининга с использованием стандартных диагностических серологических методов для  всех видов бабезий, которые заражают собак. Наиболее часто используемый антиген в практике и научных исследованиях -антиген B. canis; B. gibsoni [94, 95] и  B. microti-like sp.  антигены также  доступны, но информации по этим антигенам мало. Кроме того, специфичность и чувствительность этих методов не установлены [4]. Поэтому возможности диагностики при помощи серологических  исследований очень ограничены и требуют дальнейшего изучения. Тем не менее, ложно-отрицательные результаты ПЦР были зарегистрированы при  хроническом  пироплазмозе с  участием B. Gibsoni , обусловленные элиминацией паразита из циркулирующей крови собаки. Эти данные показывают, что в долгосрочной перспективе (до 420 дней после инфекции), инфекция  может быть выявлена серологически только ретроспективно [95].

Интерпретация положительного результата при диагностике пироплазмоза собакс использованием  серологического метода осложняется перекрестной  реактивностью между различными видами. В целом, существует значительная перекрестная реактивность между различными видами пироплазм, особенно более филогенетически родственных видов. Например, перекрестная реактивность  для больших видов пироплазм (B. canis и  B. vogeli)) может привести  к совпадению уровня антител для  разных видов. Перекрестные реакции также могут существовать между мелкими видами пироплазм (В. gibsoni) и крупными видами  (B. canis) [96] , а также между мелкими видами пироплазм  (B. gibsoni и  B. microti-like)  или между крупными пироплазмами.( B. canis, B. vogeli и  B. rossi) [28]. По этой причине положительный результат будет свидетельствовать о контакте с пироплазмами,но не может точно указать на   разновидность пироплазм.  Положительный серологический результат тоже может свидетельствовать о прошлой  или текущей инфекции. Несмотря на нечастое использование в клинической практике, молекулярные методы обеспечивают более информативную  диагностику.

Вполне возможно для собаки быть серонегативной и зараженной пироплазмозом, поскольку  инфекции видов, таких как B. canis, проявляются остро [4, 97]. Следовательно, трех- четырехнедельное  отставание в постинфекционном антителообразовании  будет создавать  серологически негативное  окно. Поэтому, сероконверсия может быть использована в качестве скринингового метода для подтверждения острой инфекции, вызываемой  пироплазмами.. В этих случаях исходные количественные серологические тесты должны быть выполнены при первичном приеме пациентас  клиническими  признаами и/или лабораторными  нарушениями. Впоследствии, количественная  серологии должна быть выполнена еще раз через 4-8 недель (см. изобр 5). Средне-высокий положительный уровень антител во время фазы выздоровления (минимум 3-4 недели после заражения) может подтвердить заражение пироплазмозом на момент первичного приема [35]. Однако имеющиеся данные о пользе  сероконверсия при пироплазмозе собак ограничены. Сероконверсия  нечасто используется  в клинической практике.

В целом, ПЦР является очень полезной  при диагностике пироплазмоза. Во-первых, ПЦР  диагностика пироплазмоза более чувствительна, чем прямое  исследование мазка крови. Во-вторых, обнаружение ДНК конкретного возбудителя в клинических условиях можно рассматривать как доказательство  активной - и, следовательно, продолжающейся - инфекции. Кроме того, в отличие от прямого обнаружения с помощью световой микроскопии или серологического исследования, ПЦР позволяет более надежного идентифицировать вид пироплазм, вызывающий инфекцию у собаки [4]. "ПЦР  с генотипированием по методу обратного линейного блоттинга [99, 100] и ПЦР -анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов[101].

 

Кроме того, различные гены  часто используются для дифференциации  между  различными видамиBabesia. Как правило, сюда относятся ядерные гены рибосомной РНК [7, 8] и два внутренних транскрибируемых спейсера  (ITS1 и ITS2) [7]. Эти молекулярные технологии позволяют нам уточнить диагноз на видовом уровне и тем самым обеспечить более точный прогноз. Наконец, ПЦР-амплификация ДНК может быть полезным методом для мониторинга лечения [102]. В идеале, для проведения молекулярного анализа с использованием ПЦР должна использоваться периферическая кровь, буферизированная этилендиаминтетрауксусной кислотой  (ЭДТА.  Кроме того, ткань селезенки также может быть полезной, хотя, как указано ниже, этот вид образцов обычно не используется, потому что он предполагает более  инвазивную  процедуру [4].

 

Сопутствующие инфекции при пироплазмозе не подтверждены документально и редко встречаются у собак. Однако секвенирование и филогенетический анализ наводят на мысль о том, что разнообразие видов пироплазм, которые сопутствующе заражают собак,  может быть большим, чем считалось ранее [15, 21]. Исследование, проведенное с 120 испанскими собаками  из Галисии и Астурии,  с клиническими признаками, совместимыми с  пироплазмозом, продемонстрировало  наличие B. microti-like у  75 собак (62.5 %), с 15 собаками, положительным  на наличие других  видов (12  с  B. canis и 3  с  B. gibsoni) [35]. [35]. Сопутствующие инфекции с другими агентами  не были   обнаружены, возможно, указывая, что сопутствующие инфекции с другими патогенами не распространены [35]. Кроме того, интересное исследование показало высокий процент сопутствующих инфекций с различными  штаммами B. canis у собак из Франции [39].

 

 Кроме того, сопутствующие инфекции с B. rossi и  B. vogeli  и тройная инфекция  B. rossi, B. vogeli и Ehrlichia canis  были зарегистрированы  у собак в Южной Африке[103]. В отличие от редких случаяхсопутствующих инфекций с различными видами пироплазм,  часто можно найти в эндемичных зонах собак с сопутствующими инфекциями, вызванными другии патогенами, такими как Leishmania spp.,Ehrlichia/Anaplasmaspp., Hepatozoon spp.или  Rickettsia conorii,  в зависимость от географической зоны и распределения соответсвующих членистоногих переносчиков инфекции. [93, 104]  Кроме того, следует отметить, что сопутствующие инфекции имеет важное клиническое значение по нескольким причинам: это усложняет диагностику, усугубляет клинические признаки, снижает эффективность лечения и может ухудшить прогноз [104].

В целом, уровень антител к пироплазмам . начинает уменьшаться через три недели после начала лечения и постепенно снижается  примерно  в течение 160 дней [133]. Результаты  титров антител  всегда следует интерпретировать с осторожностью, поскольку повышенные уровни антител  постоянно  коррелируют с персистирующей инфекцией. [134]. Для некоторых видов пироплазм  (например, B. gibsoni),),  нормально обнаруживать  положительные уровни антител после лечения, что затрудняет интерпретацию положительных результатов [111]. Взятые вместе, эти ограничения, наряду с уже описанными для серологических анализов, делают нецелесообразным использование этих методов приемы при последующем наблюдении за болезнью.

ПЦР является полезной стратегией скрининга учитывая, что многие собаки остаются хронически инфицированы пироплазмами. Их  статус хронически инфицированного животного предрасполагает этих собак к рецидиву или к сохранению хронически ненормального - а значит вредного  - клинического  состояния. При таких обстоятельствах, ПЦР может быть использована для того, чтобы установить, сохраняется  ли инфекция или скорее всего устранена. [4, 10]. ПЦР следует проводить до прерывания лечения и приблизительно через 2 мес после завершения лечения, особенно при наличии мелких видов бабезий. Кроме того, поскольку чувствительность ПЦР по выявлению пироплазм  в цельной крови менее 100 %, может быть целесообразным  выполнение  двух последовательных ПЦР-тестов, разделенных, по меньшей мере, 15 днями [102, 111]. Кроме того, паразитарное очищение  может быть строго продемонстрировано только если ПЦР проводится с использованием  нескольких аспиратов  тканей, например, из селезенки, а не только периферической крови [10]. Высокая  стоимость несколько тестов селезеночной ПЦР, как правило, ограничивает ее использование в научно-исследовательской   сфере        и  в качестве доказательства в  исследованиях терапевтического ответа.

Клиническое излечение и хороший терапевтический ответ с большей вероятностью достигается при  наличии бабезий  большого размера, чем при наличии  мелких видов, последние, как правило, более устойчивы к классическим методам лечения [4]. Используются несколько терапевтических протоколов, направленных на лечение инфекций, вызванных мелкими видами бабезий, хотя паразитологическое  выздоровление  считается  редким. Сохранение B. gibsoni  у собак после лечения различными протоколами с использованием  клиндамицина, метронидазола, доксициклина, диминазена, имидокарба дипропионата, atovaquone и азитромицина является свидетельством устойчивости этот паразита [111, 112,116, 119].

Одна и та же собакаможет быть повторнозаражена идентичным видом бабезий или одновременно  вторым видом. Хотя клинические последствия повторной инфекции достаточно не определены, в эндемических регионах это возможно у хронически инфицированных собак, всостоянии премуниции, безклинических последствий; это состояние может быть даже полезным в плане защиты от  инфекции в будущем[133].

Преобладающий акцент в профилактикепироплазмоза собак сделан на контроле клещей. Однако такой подход осложняется экологической природой, связанной с человеком, по крайней мере, некоторых  из клещей, участвовующих  в передаче пироплазм. Эффективная трансовариальная передача пироплазм в клещах означает, что популяции клещей в эндемичных районах могут  оставаться зараженными в течение длительного времени и что собаки в зонах с клещами будут  часто становиться повторно инвазированными  и в  геометрической прогрессии увеличивать популяцию клещей.
Клещевая  профилактика должна охватывать весь период, в течение которого клещи активны, в зависимости от уровня риска и образа жизни собак. Эта профилактика может состоять из регулярной  проверки собак  на наличие клещей владельцами и  ветеринарами  и регулярного применения акарицидных обработок.

Мероприятия по предупреждению передачи инфекций, вызываемых  Babesia,должны сосредоточиться в первую очередь на следующем:
1. 1.
Все прикрепившиеся  клещи должны быть удалены. Владельцы собак  должны быть осведомлены о важности удаления клещей как можно скорее. Доступно большое разнообразие специально разработанных инструментов для удаления клеща (они могут использоваться для удаления клещей, прикрепившихся к коже; масло, спирт или эфир, не рекомендуются).
2. 2.
Собаки и кошки, путешествующие в регионы с клещами и эндемичные  для пироплазмоза должны также получать регулярную акарицидные обработки, особенно если это заболевание не распространено в их районе.
3. 3.
Используйте  акарициды с остаточным  действием и водостойкостью.
4. 4.
Применяйте хорошее знание сезонности клещей. Клещи могут быть активны и паразитировать на  собаках  выше средней  температуры воздуха окружающей среды  + 12 °C. Ниже этой температуры,  вероятность инвазии собак клещами значительно уменьшается, что существенно облегчает клещевой контроль.. Хотя контроль клещей  классически рекомендуется между весной и осенью, последние исследования показывают, что в некоторых областях, она должна применяться в течение всего года [135, 136]; однако, эта рекомендация должна быть рассмотрена в соответствии с местными условиями.
5. 5.
Удаление клещей из питомников является невозможным; следовательно, единственным и безопасным способом, чтобы избежать размножения клещей в  питомниках  и помещениях  является защита собак, которые являются только «переносчиками» клещей.
Активные  соединения,  считающиеся  эффективными для лечения и профилактики клещевой инвазии у собак, включают в себя широкий спектр эктопаразицидов, которые показали различное воздействие на клещей (отпугивание, уменьшение  аппетита или отпугивание   от пищи, нарушение фиксации, изгнание и/или эффект уничтожения),

поэтому важно использовать подходящие  акарициды,чтобы  убивать клещей как можно быстрее, прежде чем выпускаются возбудители заболевания. Для пироплазмоза, даже  лучше предотвратить клещей от  прикрепления (отпугивание клещей  в узком смысле) [137].